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版纳园研究揭示一种构建人工miRNA载体的新策略

  Banna Park研究揭示了构建人工miRNA载体的新策略

  主要通过遗传修饰的DNA和其他技术来反向遗传学,有目的地和精确地重新定位基因的精细结构,以确定这些变化对生物体的表型性状的直接影响。为了研究基因在植物中的功能,研究人员通常需要通过RNAi技术获得该基因的功能丧失突变体或抑制目标基因的表达。由于目前常见的突变体文库只有少数植物突变体,因此通过RNAi技术研究该基因的生物学功能来抑制目的基因的表达,是反向遗传学中常用的关键方法之一。然而,通过使用双链RNA(RNAi)技术产生小RNA来干扰靶基因表达通常导致脱靶 - 即非靶标基因表达的非特异性抑制,这最终导致干扰研究者分析靶基因的生物学功能。
\\ u0026> miRNA是在转录(或)翻译水平特异性抑制靶基因表达的一类小RNA。 miRNA的功能正好弥补了传统RNAi的不足。近年来,研究人员利用自然miRNA的产生和作用原理,利用人工miRNA抑制一种或多种感兴趣基因的表达。目前,构建人工miRNA前体主要是通过重迭PCR来完成的,通常需要4次PCR反应才能产生最终的人工miRNA前体结构。该技术有三个缺点:(a)过度的PCR反应步骤增加了碱基突变的可能性; (b)过程耗时;和(c)不适合批量操作。为了改进这一技术,中国科学院西双版纳热带植物园植物分子生物学研究组的研究人员梁刚和于迪秋成功构建了两套人工miRNA载体(pAMIR395a和pAMIR319a)。这两个载体含有天然miRNA前体5和3区域。研究人员可以通过PCR反应产生所需的人工miRNA前体,产生相应的人工miRNA发夹区,然后通过限制性内切酶连接克隆到相应的人工miRNA载体中。实验证明,该方法构建的人工miRNA前体能够产生成熟的人工miRNA,能够有效抑制相应靶基因的表达。此外,本研究还证明两个人工miRNA前体可以串联表达为同一个顺反子,顺反子产生的两个人工miRNA可以同时有效地抑制其靶基因的表达。抑制多个基因的表达提供技术支持。这一技术进步使研究人员能够在更短的时间内分批构建人工miRNA前体。
\\ u0026>在国际学术期刊Planta(2012,235:1421-1429; DOI 10.1007 / s00425-012-1610-5)中发表的一项在拟南芥中构建人工miRNA载体的新策略中展示了这项研究的进展。

  关键词:技术研究成功结构出版

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